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부자추출물의 골격근 세포에서의 에너지 조절 작용
Effect of Aconitum carmichaeli Debx on Energy Metabolism in C2C12 Skeletal Muscle Cells
J Korean Med Obes Res 2016;16:109-15
Published online December 30, 2016;  https://doi.org/10.15429/jkomor.2016.16.2.109
Copyright © 2016 The Society of Korean Medicine for Obesity Research.

SongMi-Young

동국대학교 한의과대학 한방재활의학교실

Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Dogguk University
Mi-Young Song Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Dogguk University,123 Dongdae-ro, Gyeongju 38066, Korea Tel: +82-54-770-1256 Fax: +82-54-770-1200 E-mail: miyoungsong@dongguk.ac.kr
Received November 21, 2016; Revised November 30, 2016; Accepted November 30, 2016.
cc This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract

Objectives:

The all anti-obesity drugs currently approved by the US Food and Drug Administration work by reducing energy intake. In fact, no approved drug targets energy expenditure. In Korean medicine, it is known to Qi or Yang invigorating therapy could increase energy metabolism. Aconitum carmichaeli Debx (ACD) is a Yang invigorating herb, often used for treat obesity in Korean medicine. In the present study, the authors investigated the regulatory effects of ACD in energy metabolism and mitochondrial biogenesis in C2C12 skeletal muscle cells.

Methods:

The water extract of ACD (0.2, 0.5 and 1.0 mg/ml) were treated in differentiated C2C12 cells. The protein or mRNA levels of target genes were analyzed and mitochondrial mass were investigated.

Results:

ACD activated the expressions of peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC-1α), nuclear respiratory factor 1 and TFAM and increased mitochondrial mass. ACD also increased adenosin monophosphate-activated protein kinase (AMPK), and acetyl-CoA carboxylase.

Conclusions:

This study suggests that ACD has the potential to increase energy metabolism and mitochondrial biogenesis by activating AMPK and PGC1α.

Keywords : Aconitum carmichaeli Debx, Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha, AMP-activated protein kinases, Energy metabolism, C2C12
서론

비만 인구가 유행병처럼 증가하고 있다. 2014년 기준, 전 세계적으로 성인 인구 중 약 19억 명이 과체중 이상이며, 그 중 6억 명 이상이 비만인 것으로 나타났다1). 국내에서도 비만 유병률이 가파르게 증가하고 있는데, 2015년 국민건강영양조사를 통해 성인 인구의 33.2%가 비만인 것으로 보고되었다2). 비만 및 비만으로 유발되는 다양한 합병증들에 관한 위험성 문제는 전 세계적으로 관심의 대상이 되고 있지만, 효과적인 비만치료제 개발은 미비한 상태이다. 비만치료의 방법은 크게 ‘에너지 흡수(energy intake) 억제’ 또는 ‘에너지 소비(energy expenditure) 증가’의 두 가지로 나눌 수 있다3). 현재 미국식품의약국(Food and Drug Administration)에서 승인된 비만 치료제는 중추 신경에 작용하여 식욕을 억제시키는 식욕억제제 또는 위장관에서 지방의 체내 흡수를 억제하는 약물이며, 에너지 소비 증가 효능으로 승인된 약물은 없는 상황이다4). 식욕억제제는 중추신경계에 작용하므로 향 정신성 부작용을 일으킬 수 있으며, 또한 식욕 억제제를 통한 장기간의 식이제한 시 인체 항상성 조절 기전으로 기초대사율이 저하되어 체중 감량 효과가 점차 줄어든다는 문제점이 있다. 따라서 보다 효율적이며 안정적인 비만 치료를 위해서는 에너지 소비 증가를 통한 항비만 작용의 약물 개발이 필요하다3).

한편 골격근은 미토콘드리아가 가장 풍부한 조직으로 에너지 대사 및 열생산의 핵심기관이며 당 및 지방산 대사 조절을 통해 비만 및 2형 당뇨병 발현에 직접적으로 영향을 미치는 기관이다3-6). 골격근 내에서 peroxisome proliferator- activated receptor gamma coactivator 1-α (PGC-1α)는 세포 에너지 대사의 핵심 인자로 지방산 산화를 조절하고, 미토콘드리아 생합성을 증가시키는 작용을 한다7). Adenosin monophosphate-activated protein kinase (AMPK) 역시 세포 내 에너지 항상성 유지에 관여하는 효소로 골격근 내에서 지방산의 산화와 당 흡수를 촉진하며, 근육 내 AMPK의 활성화는 PGC-1α 발현을 직접적으로 증가시키는 것으로 알려져 있다8).

생체 에너지는 한의학에서의 氣의 개념으로도 이해할 수 있는데9), 한의학에서 氣의 작용은 推動 및 溫煦 작용으로 대표된다10). 이에 저자는 보기 혹은 보양 약물의 추동 및 온후 작용이 에너지 대사를 조절할 수 있을 것이라는 데 연구 아이디어에 착안하여, 한약 중 특히 보기, 보양 약물을 중심으로 에너지 대사 조절 효능을 연구하여 왔다. 그 결과 황기11), 육계, 부자12), 백출13)의 골격근 세포에서 에너지 대사 조절 효능을 확인할 수 있었다. 그 중 부자(Aconitum carmichaeli Debx)는 골격근 세포에서 adenosine triphosphate (ATP) 생성을 증가시키고, 세포내 당 대사를 증가시킴을 확인하였지만12), 관련 연구가 부족하여 본 연구에서 미토콘드리아 생합성 관련 및 에너지 조절 관련 인자들의 발현 변화 확인을 통해 부자의 생체 에너지 조절 효능을 보다 구체적으로 연구하고자 하였다.

재료 및 방법

1. 약재

부자는 포부자(광명당제약, 울산, 한국)를 구입하여 부자 200 g에 정제수 2 L를 가하여 열탕 추출기에서 3시간씩 2회 가열하여 얻은 추출물을 여과지(Whatman NO. 1; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 여과한 후 감압 농축하여 동결 건조한 물 추출물을 조제하였다(수득률 22.5%).

2. 세포배양

C2C12 골격근세포(CRL-1772; ATCC, Manassas, VA, USA)는 10% fetal bovine serum (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) 및 1% penicillin/streptomycin mix (Invtrogen)를 함유한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Invitrogen)으로 배양하였다. C2C12 세포의 분화 유도를 위해, 100% confluence가 되면 2% horse serum을 포함한 배지로 바꾸어 24시간마다 배지를 교환하면서 4일간 분화시킨 후 약물을 처리하였다. 동일 약물 및 세포 모델을 사용한 이전 연구에서 세포 독성 실험을 통해 부자 1.0 mg/ml 농도에서 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였으며12), 이를 근거로 부자추출물을 0.2, 0.5 및 1.0 mg/ml의 농도로 처리하였다.

3. Western blot

이상과 같은 방법으로 세포를 분화시킨 후, 농도별로 약물을 45분간 처리하였다. 세포를 수거하여 5,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 phosphate buffer saline (PBS) 용액으로 2회 세척하고 lysis 용액(50 mM 4-(2-hydroxyethyl)- 1-piperazineethanesulfonic acid, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% deoxycholate, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride, 1 μg/ml aprotinin)을 이용하여 부유시킨 후 얼음에 30분간 반응시켰다. 20 μg의 단백질을 2× sample buffer (100 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM dithithreitol, 4% sodium dodecyl sulphate [SDS], 0.2% bromophenol blue, 20% glycerol)와 섞어 100°C에서 3분 끓인 다음 8%∼15% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis를 이용하여 분리하였다. 전기영동을 통해 분리된 gel의 단백질을 nitrocellulose membrane으로 4°C, 30 V로 16시간 동안 transfer시켰다. Membrane은 10% skim milk로 실온에서 1시간 동안 blocking한 다음, 각 단백질의 항체와 상온에서 2시간 반응시켰다. 이를 tris buffered saline with Tween 20로 3회 세척한 후 anti- pAMPK, AMPK (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)로 각각 처치한 후, 상온에서 1시간 반응시키고 enhanced chemiluminescence 용액으로 기질반응시켜 X-ray film에 감광하였다. X-ray film상의 밴드는 이미지(Image-J) 프로그램을 이용하여 AMPK에 대한 pAMPK의 발현 비율로 표시하였다.

4. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)

분화된 골격근 세포에 농도별로 약물을 24시간 동안 처리하였다. 각 세포를 수거하여 5,000 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 TRIzol 시약을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA에 역전사 중합효소(reverse transcriptase)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 PGC-1α, nuclear respiratory factor 1 (NRF1), mitochondrial transcription factor (TFAM) 및 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase의 primer들(Table 1)을 각각 혼합하고, 10× PCR buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250 μM dNTP, 1 U Tag polymerase 등을 혼합한 후 denaturation을 위해 94°C에서 30초, annealing을 위해 55°C∼60°C에서 30초 및 extension을 위해 70°C에서 60초 조건에서 30 cycles을 수행하였다. 이상으로 얻어진 반응물을 EtBr이 포함된 1.5% 한천(agarose) gel에서 전기영동한 후, ultraviolet lamp를 이용하여 확인하였으며, 이미지(Image-J) 프로그램을 이용하여 도표화하였다.

Primer Sequences for Polymerase Chain Reaction Analysis

PrimersForwardReverse
 PGC-1α CAC CAA ACC CAC AGA AAA CAGGGG TCA GAG GAA GAG ATA AAG TTG 
 NRF1AAT GTC CGC AGT GAT GTC CGCC TGA GTT TGT GTT TGC TG
 TFAMCAC CCA GAT GCA AAA CTT TCA G CTG CTC TTT ATA CTT GCT CAC AG
 GAPDHATT CAA CGG CAC ACT CAA GGCAG TGT AGC CCA AGA TGC CCT

PGC-1α: peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha, NRF1: nuclear respiratory factor 1, TFAM: mitochondrial transcription factor, GAPDH: glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.



5. Mitochondrial mass 측정

미토콘드리아 양은 10-N-Nonyl acridine orange (NAO; a fluorescent probe) (ENZO Life Sciences, East Farmingdale, NY, USA) 염색을 이용하여 측정하였다. 분화된 골격근 세포에 농도별로 약물을 24시간 동안 처리하한 후, 빛은 차단한 상태에서 10 nM 농도의 NAO로 10분간 염색하였다. 그 후 trpysin으로 세포를 수거하고 PBS로 2회 washing한 후, luminometer (Promega, Fitchburg, WI, USA)를 이용하여 540 nm 파장에서 형광 발현도를 측정하였다.

6. 통계분석

GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 이용하여 통계처리하였다. 각 3회의 반복 실험의 결과를 mean±standard errors of mean으로 나타내고, analysis of variance (Tukey’s test)를 사용하여 분석하였으며, 통계적인 유의성은 P-value가 0.05 이하인 경우에 인정하였다.

결과 및 고찰

1. 골격근 세포에서 부자의 PGC-1α 활성화 효능

PGC-1α의 mRNA 및 단백질 발현량을 측정했을 때, 부자 1.0 mg/ml 농도에서 모두 유의하게 증가한 것으로 나타났다(Fig. 1). Peroxisome proliferator-activated receptor- gamma의 coactivator인 PGC-1α는 세포 내 에너지 대사를 조절하는 핵심 인자로 당 대사에도 관여하는데, glucose transport 4를 증가시켜 당 대사에 관여하는 것으로 알려져 있다14). 본 연구자의 이전 연구에서 부자는 골격근 세포 내에서 당대사를 증가시키는 것을 확인하였는데, 구체적으로 glucose uptake를 증가시키고, glucose consumption을 상승시켰다12). 본 결과를 통해 부자의 골격근 세포 내 당대사 조절 효능은 PGC-1α의 증가와 관련 있을 것으로 생각된다.

Fig. 1.

Effect of ACD extract on the expression of PGC-1α in C2C12 cells. PGC-1α mRNA (A) and protein (B) levels were determined by reverse transcriptase-polymerase chain reaction and Western blot. Values in histogram are the mean±standard errors of means of the three independent experiments. ACD: Aconitum carmichaeli Debx, PGC-1α: peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha, GAPDH: glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. *P<0.05 and="" p="" 0="" 01="" versus="" non-treated="" differentiated="" cells="" p="">



2. 골격근 세포에서 부자의 NRF1 및 TFAM 활성화 효능

PGC-1α는 또한 미토콘드리아 생합성을 증가시키는데, PGC-1α가 전사인자인 NRF-1 및 TFAM을 활성화시키고, 이는 미토콘드리아 증식과 DNA의 전사를 촉진하여 미토콘드리아 생합성을 증가시키는 것으로 알려져 있다15). NRF-1 및 TFAM의 mRNA 발현량을 측정한 결과, 부자가 농도 의존적으로 두 전사인자의 mRNA 발현량을 증가시키는 것으로 나타났다(Fig. 2). 따라서 부자가 골격근 내 미토콘드리아 생합성 증가에 관여하리라 추측할 수 있다. 미토콘드리아는 ATP 및 열생산 작용을 하는데, 이전 연구에서 부자추출물 1.0 mg/ml의 농도에서 ATP 생산이 유의하게 증가함을 확인할 수 있었는데, 본 연구결과는 이전 연구결과와 일치하는 바이다.

Fig. 2.

Effect of ACD extract on the expression of TFAM and NRF1 in C2C12 cells. The mRNA levels of TFAM (A) and NRF1 (B) were determined by reverse transcriptasepolymerase chain reaction. Values in histogram are the mean±standard errors of means of the three independent experiments. ACD: Aconitum carmichaeli Debx, TFAM: mitochondrial transcription factor, GAPDH: glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, NRF1: nuclear respiratory factor 1. *P<0.05 and="" p="" 0="" 01="" versus="" non-treated="" differentiated="" cells="" p="">



3. 골격근 세포에서 부자의 미토콘드리아 양 증가 작용

부자 처치로 미토콘드리아 생합성이 증가하여 실제적으로 미토콘드리아 양이 증가되었는지를 확인하기 위하여 NAO 형광 염색법을 통해 실험하였다. NAO는 미토콘드리아 내막에 있는 cardiolipin에 특이적으로 부착되는 특징이 있으므로, 미토콘드리아 양이 증가할수록 NAO를 통한 형광 발현량이 증가하게 된다16). 부자 처리 후 농도 의존적으로 세포내 NAO 부착으로 인한 형광 강도가 증가하는 것으로 나타났으며, 이를 통해 미토콘드리아 양이 증가하였음을 간접적으로 확인할 수 있었다(Fig. 3).

Fig. 3.

Effect of ACD extract on mitochondrial mass in C2C12 cells. The mitochondrial mass were measured by fluorescence staining with NAO. Values in histogram are the mean±standard errors of means of the three independent experiments. NAO: Nonyl acridine orange, ACD: Aconitum carmichaeli Debx. *P<0.05 and="" p="" 0="" 01="" versus="" non-treated="" differentiated="" cells="" p="">



4. 골격근 세포에서 부자의 AMPK 활성화 효능

AMPK는 인산화를 통해 PGC-1α 활성화에 직접적으로 작용한다8). 이에 부자의 PGC-1α의 활성화 작용에 AMPK의 관련성을 평가하기 위하여 AMPK 및 pAMPK의 단백질 발현량을 측정하였다. 이전 연구에서 부자가 AMPK의 인산화를 증가시키는 것으로 나타났지만 단일농도(1.0 mg/ml)만으로 처리되었기 때문에 농도에 따른 발현량의 변화 및 약물의 작용 여부를 보다 명확히 하기 위하여 부자추출물을 농도별로 처리하고 발현량을 측정하였다. 그 결과 부자 0.5 및 1.0 mg/ml의 농도에서 AMPK의 인산화가 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 이는 앞선 PGC-1α 발현량의 변화와 일치하는 내용으로 부자는 AMPK 활성화를 통해 PGC-1α를 증가시키는 것으로 예상된다(Fig. 4).

Fig. 4.

Effect of ACD extract on phosphorylation of AMPK in C2C12 cells. The protein levels of total AMPK and phosphorylated AMPK were determined by Western blot. Values in histogram are the mean±standard errors of means of the three independent experiments. ACD: Aconitum carmichaeli Debx, AMPK: adenosin monophosphate-activated protein kinase. *P<0.05 and="" p="" 0="" 01="" versus="" non-treated="" differentiated="" cells="" p="">



5. 골격근세포에서 부자의 acetyl-CoA carboxylase (ACC) 억제 효능

AMPK가 활성화되면 지질합성에 관여하는 유전자인 ACC가 인산화 및 불활성화된다17). ACC는 AMPK 하위신호전달 단백질인 ACC의 발현량을 평가하여, 부자의 AMPK 활성 경로를 보다 명확히 하고자 하였다. ACC 및 pACC의 단백질 발현량을 측정한 결과, 부자 1.0 mg/ml에서 ACC의 인산화가 증가되는 것으로 나타났으며(Fig. 5), AMPK의 인산화 결과와도 일치하는 내용이었다. 따라서 부자가 골격근 내에서 AMPK 활성화에 작용함을 보다 명확히 인식할 수 있었다.

Fig. 5.

Effect of ACD extract on phosphorylation of ACC in C2C12 cells. The protein levels of total ACC and phosphorylated ACC were determined by Western blot. Values in histogram are the mean± standard errors of means of the three independent experiments.



ACD: Aconitum carmichaeli Debx, ACC: acetyl-CoA carboxylase. *P< 0.05 versus non-treated differentiated cells.

한의학에서 氣란 인체를 구성하고 생명을 유지하는 기본적인 요소로 推動, 溫煦, 氣化作用을 나타내며10), 氣의 溫煦 작용이 약해지면, 陽虛로 발전되어 寒證과 機能低下 상태가 나타나게 된다18). 한의학에서는 비만의 유형을 陽虛, 脾虛, 食積, 肝鬱, 痰飮, 瘀血의 6가지로 나누어 변증하는데19), 그 중 식적, 담음, 어혈 등의 병리적 산물도 근본적으로는 기허 및 양허의 병리 상태에서 기인할 수 있으며20), 비만의 유병률이 상승하는 중장년층일수록 기능 부전에 따른 기허의 병리가 심화되므로, 비만 치료에 있어 기허, 양허의 병리는 중요하게 강조되어야 한다. 대사율 증가, 즉 에너지 소비 증가 작용을 통한 항비만 효능은 미토콘드리아의 작용과도 연관되며, 이는 미토콘드리아의 에너지 생산과 열발생 작용으로 나타난다3). 아직 생체에너지 및 미토콘드리아의 작용과 관련된 항비만 약물은 개발되지 않은 상태이므로, 한약 특히 보기, 보양 한약에서 그 가능성을 찾을 수 있을 것이라 기대된다.

한의학에서 부자는 熱性을 가진 대표 약재로 補火助陽, 回陽退陰, 溫中止痛의 효능을 나타내는 대표적인 보양제이다21). 변증에 따라 부자를 비만 치료를 위한 한약 처방에서 배합하여 사용하고 있지만, 부자의 항비만 효능에 대한 관련 연구는 부족한 상황이다. 3T3-L1 지방세포 배양모델에서 부자는 지방분화 조절에 유의한 효능을 나타내지 못했는데, 지방세포모델에서의 단순 분화조절 평가 실험은 에너지 조절을 통한 항비만 효능을 평가 모델로는 적합하지 않다고 생각한다22). 또한 동물 및 인체에서 항비만 작용 관련 연구는 찾기 어려웠으며, 부자의 열 발생 효능과 관련하여 비만형 동물 모델이 아닌 일반식 사료를 공급한 실험쥐에 2주간 부자를 투여했을 때. 부자가 골격근내 UCP 3의 발현량을 증가시킨 것을 확인할 수 있었다23). 부자의 주요 성분은 aconitine, mesaconitine 등인데24), 본 연구에서는 독성 성분을 완화시키기 위한 전통 수치 방법으로 가공된 포부자를 사용하였다. 부자의 주요 성분과 항비만, 항당뇨 및 에너지 조절 관련 효능은 특별히 연구된 바가 없었다.

한편, 부자는 본 실험과 동일한 골격근세포 모델을 사용한 저자의 선행연구에서 당대사를 증가시키고, ATP 생산을 증가시키는 것으로 나타났다12). 본 연구에서는 에너지 조절 및 미토콘드리아 생합성과 관련된 PGC-1α 및 NRF1, TFAM의 발현량을 증가시키고 이를 통해 미토콘드리아 양을 증가시켰다. 또한 생체 에너지 조절의 또 다른 센서이며, PGC-1α를 직접적으로 증가시키는 작용을 하는 AMPK의 활성을 증가시킴을 알 수 있었다. 이는 선행 연구 결과와 약물의 작용 경로가 일치하는 바이며, 이상을 통해 부자가 미토콘드리아 생합성에 관여하며 에너지 대사를 조절에 작용할 것으로 추측된다. 따라서 비만형 동물 모델을 이용한 추후 연구를 통해 부자의 항비만 효능, 에너지 대사 조절 및 미토콘드리아 기능 조절 효능을 보다 구체적으로 평가할 필요가 있다. 또한 부자뿐만 아니라 여러 한약에서 생체 에너지 조절을 통한 항비만 효능 평가 연구를 계속적으로 진행하여 기존의 항비만 양약과 차별되는 한약의 효능을 과학적으로 규명 및 발견할 필요가 있다.

감사의 글

본 연구는 보건복지부의 재원으로 한국보건산업진흥원의 보건의료기술연구개발사업 지원에 의하여 이루어진 것임(과제고유번호 : HI15C0127).

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December 2018, 18 (2)
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