1. 실험재료
실험에 사용한 삼정환 및 삼정환의 재료인 상심자, 지골 피, 창출은 동국대학교 일산한방병원에서 구입하였다. 실험 에 사용된 삼정환은 상심자, 지골피, 창출을 일정 비율 (3:1:1)로 구성하여 21 g 및 20 g의 건조 시료를 준비하였 다. 각각의 건조 시료에 30% 에탄올(100 ml)을 첨가하여 1 시간 열탕 추출을 진행하여 추출액을 얻었으며, 이를 감압 농축하여 1.5 g (3:1:1 혼합 시료)을 확보하였다.
2. 3T3-L1 세포의 배양 및 분화유도
마우스 지방전구세포인 3T3-L1 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에 서 분양받아 사용하였다. 배양은 Dulbecco’s modified Eagle’s medium high glucose (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 10% fetal bovine serum (Invitrogen)과 100 unit/ml peniciillin, 100 μg/ml streptomycin (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)를 첨가하여 5% CO2, 37oC의 환경에서 배양하였다. 세포가 100% confluent한 상태가 되면 4×103 cells/well의 밀도로 96 well에 분주한 후 48시간 배양하였다. 이후 DMEM에 1 μM dexamethasone (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), 10 μg/ml insulin (Sigma Aldrich), 0.5 mM 3-isobutyle- 1-methylxanthine (IBMX; Calbiochem, Darmstadt, Germany)이 첨가된 분화배지를 사용하여 72시간 동안 분 화를 유도한 후 분화된 지방세포에 혼합추출 삼정환과 개별 추출 삼정환 시료를 각각 Oil red O staining을 위해 well당 200 μg/ml의 농도로 처리하였고, 대조군으로는 약물처치 없이 동일한 양의 배지만을 첨가하였다. 세포생존율 실험을 위해서는 2×103 cells/well의 농도로 96 well plate에 배양 한 후 분화를 유도시키지 않은 채 복합추출 삼정환과 개별 추출 삼정환을 각각 농도별로(50, 100, 200, 400 μg/ml) 첨 가하여 24시간 동안 배양한 후 Ex-cytox assay를 통한 세포 생존율을 구하였다. Real-time polymerase chain reaction (PCR)법에는 분화시키지 않은 3T3-L1세포를 사용하였다.
3. DPPH 자유라디칼 소거능
한약재의 자유라디칼 소거활성을 확인하기 위하여 자유 라디칼인 DPPH (Sigma Aldrich)에 대한 환원력을 측정하 였는데, 각 군별 삼정환을 희석하여 농도별로(0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 mg/ml) 준비하였다. DPPH를 에탄올에 녹여 300 μM DPPH/EtOH를 준비하고 760 μl당 각 샘플 40 μl 를 혼합하였다. 혼합한 시료들을 37oC에서 30분간 반응시 킨 후 96 well plate에 옮겨 VersaMax ELISA Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용 해 515 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 양성 대조군으로 는 ascorbic acid를 사용하였다. Free radical의 억제율 (inhibition rate)은 하기 공식을 통해 구하였다.
Inhibition rate=(control optical density [O.D]-sample O.D)/ control O.D×100
4. 총 페놀함량 분석
총 페놀함량은 Folin-Ciocalteu 방법16)을 이용하여 실험 하였다. 혼합추출한 삼정환과 개별추출을 통해 얻은 삼정 환, gallic acid를 각각 40 μl씩 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent (Sigma Aldrich) 200 μl, 증류수 1,160 μl와 함께 혼합한 후 실온에서 3분 동안 반응시켰다. 반응물에 20% sodium carbonate 600 μl를 첨가하여 어두운 실온에서 2시 간 동안 반응시킨 후 UV ELISA microplate reader를 이용 해 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 표준물질 인 gallic acid를 이용하여 작성된 표준곡선으로부터 총 페 놀 함량을 환산하였다.
5. Oil red O 염색
약재를 처리한 분화된 3T3-L1세포의 배지를 모두 제거 한 후 phosphate buffered saline (PBS)로 세척한 후 10% formaldehyde 용액으로 5분간 상온에서 반응시켰다. 반응시 킨 formaldehyde 용액을 버리고 새로운 10% formaldehyde 용액을 가하여 parafilm을 이용해 밀봉한 뒤 1시간 동안 추 가적으로 고정시켰다. Formaldehyde 용액을 버린 후 60% isopropanol을 통해 세척하여 완전히 마르도록 기다리고 Oil red O working solution (Sigma Aldrich)을 첨가하여 상온에서 10분간 염색한 후 용액을 제거하여 즉시 증류수 로 세척하였다. 염색된 지방세포는 100% isopropanol로 용 해하여 충분히 pipetting한 시료를 96 well plate에 1 ml씩 분주하여 UV ELISA microplate reader를 이용해 520 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 대조군에 대한 상대적인 값을 구하기 위해 하기 공식을 사용하였다.
Relative absorbance value=(experimental value/control)×100
6. 세포생존율
세포생존율의 측정은 Water soluble tetrazolium salt (WST)를 이용한 EZ-Cytox enhanced cytotoxicity assay kit (iTSBiO, Seoul, Korea)를 사용하였다. 약재를 처리한 분화된 3T3-L1세포에 한 개의 well당 10 μl의 WST solution을 첨가하여 배양기에서 2시간 동안 반응시킨 후 UV ELISA microplate reader를 이용해 562 nm에서 흡광 도를 측정하였다. 결과는 대조군에 대한 상대적인 값을 구 하기 위해 하기 공식을 사용하였다.
Relative absorbance value=(experimental value/control)×100
7. Real-time PCR
분화시키지 않은 미분화 지방세포에 배지만을 사용한 대 조군과 복합추출 혹은 개별추출 삼정환을 가한 후 2시간 동 안 배양시킨 후 배지를 제거하여 PBS로 세척하여 Trizole reagent (Invitrogen)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 각 군에서 얻은 2 μg의 RNA는 cDNA synthesis kit (SprintTM RT Complete Oligo(dT)18; Clontech, Mountain View, CA, USA)를 이용해 역전사하였다. 각 시료는 Light- Cycler-FastStart DNA Master SYBR Green (Roche, Indianapolis, ID, USA)과 각 primer (Table 1)를 사용해 LightCycler instrument (Roche 480 real time PCR system)를 통해 진행하였다. PCR 증폭은 초기변성 95oC 10초, 적정 변동온도(Table 1)에 따라 10초, 신장반응 72oC 15초로 하여 cycle 동안 진행하였다. 실험결과는 Light- Cycler Software (Roche)를 통해 분석하였고 유전자의 발 현량은 2^(-ΔCt)를 구하는 방식으로 계산하였으며, 결과는 house keeping gene β-actin을 나누어 상대적인 값을 측정 하였다.
8. 통계방법
측정값은 평균(mean)과 표준편차(standard deviation)로 표시하였으며, 각 실험군 간의 통계적인 분석은 Student’s t-test (IBM SPSS version 20.0.0 for Windows; IBM, Armonk, NY, USA)를 통해 시행하였다. 모든 실험은 1회 시행하였으며, Oil red O 염색, DPPH 자유라디칼 소거능, 총 페놀함량 분석, 세포생존율 실험은 3개의 well을 사용해 측정한 평균값을 사용하였고, real-time PCR은 2개의 well 의 평균값을 사용하였다. 통계적인 유의성은 P-value가 0.05 이하인 경우에 유의한 결과로 인정하였다.